小 M 不害怕纯化“难”，IP、WB 只未肯。泡了两年实验室小 M，理论和实战经验一共有，且待我如何跃过蛋白纯化的几个“关”。

第一关 商品选择

小 M 我反正信了：此关最基本也最关键，严防“一步错，步步错”。

亲和层析做为传统、高效率的纯化方式，运用目地分子结构与填充料配基中间特殊且不可逆转的相互影响，能从体细胞裂解液或其它生物试品中，一步纯化获得较高纯目地分子结构。选择一款适宜的亲和力纯化琼脂糖，能够高效率、方便快捷、艾力可多少钱一片黄金玛卡靠谱的从生物试品中分离出来蛋白、抗体。怎么选择才算是“适宜”？静听我慢慢道来：

■抗体基本知识篇，“运筹帷幄百战不殆”

抗体 (Antibody)，别名免疫球蛋白 (Immunoglobulin，Ig)，是一种由 B 体细胞所产生的大中型 Y 形糖蛋白。抗体以一个或几个 Y 形单个存有，每一个 Y 形单个由 4 条肽链构成：两根同样的重链 (Heavy Chain) 和两根同样的轻链 (Light Chain) (图 1)。

抗体重链 Fc 区域内的非特异编码序列取决于 Ig 的种类，如 α-IgA、δ-IgD、ε-IgE、γ-IgG、μ-IgM。轻链亦有两类，分别是 λ 型 κ 型。

图 1. 抗体构造

■抗体——配位要般配！

朝思暮想纯化人源 IgG3，一通程序后，目地杂带部位空空荡荡。后来发现，当时选了 Protein A 当亲和力配位。人源 IgG3 和 Protein A，不般配！λ 轻链和 Protein L，不般配！蛋白纯化也注重门不当户不对。

抗体的亲和力纯化配位包含 Protein A、Protein G、Protein L 等。对于多数哺乳类动物，Protein G 比 Protein A 对 IgG 有更大的感染力，如人 IgG3、小白鼠 IgG1 和大白鼠 IgG2a，但 Protein G 不可以与人的 IgM、IgD、IgA 等融合。

与 Protein A、Protein G 对比，Protein L 具备更广泛的 Ig 融合水平，基本上可以结合全部带有 kappa 轻链的 Ig (IgG、IgM、IgA、IgE 和 IgD) 及多肽链可变性精彩片段 (scFv) 和 Fab 精彩片段。切记依据抗体种类，选择适合自己的亲和力纯化配位 (图 2)。

图 2. 人源抗体与 黄金玛卡怎么委婉的表达 Protein A、Protein G、Protein L 融合水平对照表

第二关 操作方法挑选

MCE Protein A、Protein G、Protein L 琼脂糖，可以从血清蛋白、细胞培养基上层清液或肝腹水中一步分离出来抗体；Anti-Flag 亲和力疑胶 可以通过 IP 等方式捕捉目地蛋白；链霉亲和素琼脂糖 则可以和生物素化样版高效率融合。

抗体纯化“大”试验，IP、Pull Down“小”实际操作，作用力柱“大”而离心管架“小”焉。杀猪岂可用宰牛刀，商品详尽操作方法献上 (如下所示计划方案仅作参考，详细各产品说明书)。

■作用力过柱法，适宜从血清蛋白等生物样版中分离出来、纯化抗体。一次实验得到很多抗体，妙！

1）充填：依据样品量取适量的琼脂糖填充料添加亲和层析柱，让贮存液靠作用力排出；2）均衡：接着用均衡 Buffer 对立柱开展均衡；3）上样、洗杂：将试品上升协调好的立柱上后，接着用均衡 Buffer 开展杂质清洗清除。4）洗脱：然后用洗脱 Buffer 将目地试品洗脱。

图 3. 作用力过柱，纯化抗体

■离心分离，适宜根据 IP 捕捉蛋白或科学研究蛋白-蛋白间相互影响。精细化管理实际操作，稳！

将 Anti-Flag 亲和力疑胶吸进离心管架，应用离心分离实际操作。离心式的形式一样经均衡 上样 洗杂 洗脱四个步骤，前三个步骤 Buffer 的更换根据离心式弃掉上清来达到，最终洗脱时离心式搜集上清。

图 4. Anti-Flag Affinity Gel 的使用方法

第三关 目地蛋白融合、洗脱

Input 明明没有目地蛋白，目地蛋白本来已融合，但洗脱液中却无目的杂带。巧设对比，巧备用，蛋白洗脱，我还在行。

■工欲善其事必先利其器，想要我“胡编乱黄金玛卡危害造”？No Way！检验结果无杂带，或许是下列缘故。

PS：设定 Input 对比，明确目地蛋白已表述；保存上样后排出液/离心式后上层清液，明确样版已融合。每一步实际操作“留一手”，全方位复盘总结 (剖析试验失败原因) 也有帮助。

■“转性”？“非转性”？中下游试验运用来确定1）转性洗脱法 这种方法洗脱的蛋白试品后面可可以直接做 SDS-PAGE 检验，简单、高效率。2）非转性洗脱法 这种方法洗脱的蛋白试品维持原先的生物活力，适合于中后期功能设计。常见的有酸碱性洗脱法，低 pH 水准能够离解大部分抗体-抗原体相互影响。

1）蛋白一部分溶解：应用适当的蛋白酶抑制剂；如针对低 pH 自然环境特别敏感，需要在洗脱前接收管中提早添加中合液。2）蛋白非特异性结合在抗体、疑胶或离心管架内壁，提议对裂解液开展预备处理，去除非是非特异蛋白；在最后一次清洗前，将试品转移至一个新的离心管架中实际操作；清洗效果不好，提议提升清洗时间以及频次，提升清洗 Buffer 中 NaCl 或去垢剂的含量等。

第四关 WB

这里来抄个工作，3、2、1，上连接我不信这一邪！摆脱 Western Blot 风水玄学实际操作。

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产品类别

亲和层析柱

Affinity Chromatography Column 也可以搭配填充料，用以纯化具备不一样标签的酶、抗体、抗原体、重新组合蛋白等。

硫辛酸琼脂糖

Glutathione Agarose 以相对高度化学交联的 4% 琼脂糖疑胶为栽培基质，可以实现高生产量，高纯的 GST 标识蛋白西藏黄金玛卡怎么样的纯化。

Protein A 琼脂糖

MCE Protein A Agarose 以相对高度化学交联的 4% 琼脂糖疑胶为栽培基质，根据化学法定项、高效率偶联反应了重新组合 Protein A，可以从小动物肝腹水、血清蛋白、体细胞分泌物上清等生物血液中一步分离出来、纯化 IgG 等。

Protein G 琼脂糖

MCE Protein G Agarose 以相对高度化学交联的 4% 琼脂糖疑胶为栽培基质，根据化学法定项、高效率偶联反应了重新组合 Protein G，可以从小动物肝腹水、血清蛋白、体细胞分泌物上清等生物血液中一步分离出来、纯化 IgG 或者其精彩片段。

Protein L 琼脂糖

MCE Protein L Agarose 主要是用于一步分离出来、纯化含 kappa 轻链抗体的亲和层析物质。

Anti-Flag 亲和力疑胶

MCE Anti-Flag Affinity Gel 用以细菌和病毒哺乳动物细胞裂解物及其身体之外表达系统中 Flag 标识蛋白的免疫沉淀、蛋白纯化试验。

链霉亲和素琼脂糖

MCE Streptavidin Agarose 以相对高度化学交联的 4% 琼脂糖疑胶为栽培基质，根据化学法共价键偶联反应了重新组合链霉亲和素，融合能力很强，每毫升物质可以结合 30 μg D-Biotin。

巯基偶联反应琼脂糖

MCE High-Affinity Iodoacetyl Agarose 根据化学法共价键偶联反应了 Iodine acetic acid 衍生物，可以简易、迅速地融合含巯基的蛋白、活性多肽等生物配位从而形成相对稳定的巯醛基，配位固定不动后能开展亲和力纯化试验。

MCE 的全部商品仅作为科研或药证申请，大家不以一切本人主要用途给予产品与服务。